1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549使用注意事項(xiàng)
1.實(shí)驗(yàn)前應(yīng)檢查細(xì)胞的穩(wěn)定性，確保細(xì)胞的純度和活性。
2.實(shí)驗(yàn)中應(yīng)使用無(wú)菌技術(shù)，以避免外界污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
3.使用培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書(shū)的要求制備，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。
4.A549細(xì)胞應(yīng)在體外培養(yǎng)，并在合適的溫度（37℃）和濕度（5%CO2含量）下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
5.建議使用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基，例如DMEM/F12，RPMI1640等。
6.需要注意細(xì)胞的傳代，細(xì)胞傳代時(shí)必須在適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度下移植細(xì)胞，以避免過(guò)度生長(zhǎng)和細(xì)胞間的相互作用。
7.確保試劑的穩(wěn)定性和儲(chǔ)存條件，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。
8.需要預(yù)先準(zhǔn)備藥物濃度和時(shí)間等相關(guān)信息，以確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和較好的控制。
9.進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡量減少操作時(shí)間，以避免對(duì)細(xì)胞活性的影響。
10.應(yīng)盡可能避免使用有毒物質(zhì)及危險(xiǎn)試劑，保證實(shí)驗(yàn)的安全性。
